Bosch PPS8 C2 Series Bedienungsanleitung

Die Lipase aus Rhizopus oryzae: Klonierung, Expression, Reinigung undMutagenese eines industriell relevanten Enzyms für die Biokatalyse und dieStruktu

ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9Abbildung 1.1: Hydrolyse eines Triacylglycerins am Beispiel der Spaltung von Trioctanoin mit einer nichtregiospezifischen Lipa

3. DISKUSSION 99Tabelle 3.2: Vergleich der verschieden Lipasen der Famile Rhizopus sp.ROLNativ1ROLE. coli2ROLP. pastorisProROLbS. cerevisiae3ProROLE.

3. DISKUSSION 100Die pH Aktivität und Stabilität der reifen Lipasen aus Pichia pastoris und E. coli wurde untergleichen Bedingungen untersucht und zei

3. DISKUSSION 101Die niedrige Aktivität für Triglyceride mit längeren gesättigten Fettsäuren sind zum Teil aufdie schlechtere Emulgierbarkeit der ents

3. DISKUSSION 102hergestellt werden. So wurde für die Untersuchung von Metallbindungsstellen der ATPasenaus Helicobacter pylori von Volz et al. die ch

3. DISKUSSION 103Sepharose eingingen, sich aber hinsichtlich der Bindungseigenschaften bzw. des Elutions-verhalten wie gewünscht unterschieden.Die En

3. DISKUSSION 104Wildtyp, sehr stark an die Verwendung von Nickel als Metallsalz gebunden, da die Bindungan Zink zu schwach zur Verwendung in der IMAC

3. DISKUSSION 105Tags zumindest eine im Vergleich zum "ungetaggten" Protein niedrige Aktivität von10 U ml-1 (ca. 10 %) . Zur Untersuchung de

4. ZUSAMMENFASSUNG 1064 ZusammenfassungAufgabe dieser Arbeit war die Klonierung, Expression und Reinigung der Lipase ausRhizopus oryzae (ROL) in akti

4. ZUSAMMENFASSUNG 107Die Expression unter Kontrolle des pAOX Promotors war ungefähr doppelt so hoch wie dieunter Kontrolle des pGAP Promotors, weshal

5. MATERIAL & METHODEN 1085 Material & Methoden5.1 Verwendete GeräteTabelle 5.1: Verzeichnis der verwendeten GeräteFirma GeräteAmicon Ultraf

ABBILDUNGSVERZEICHNIS 10Abbildung 2.16: SDS PAGE der ROL aus Pichia pastoris kultiviert in komplexem Medium.___________66Abbildung 2.17: SDS PAGE der

5. MATERIAL & METHODEN 1095.2 ChemikalienTabelle 5.2: Verzeichnis der Hersteller der verwendeten Chemikalien und EnzymeApplied Biosystems, Weiter

5. MATERIAL & METHODEN 1105.4 Verwendete OligonukleotideTabelle 5.4 : In dieser Arbeit verwendete PrimerNameSequenz (5´ → 3´)VerwendungGFP_Who_1

5. MATERIAL & METHODEN 1115.5 Arbeiten mit Mikroorganismen5.5.1 Verwendete MikroorganismenTabelle 5.5 Alle in der Arbeit verwendeten Mikroorgani

5. MATERIAL & METHODEN 1125.5.2.1 Kultivierung von Escherichia coliE. coli wurde, soweit nicht anders vermerkt, in Luria-Bertani Medium (LB) (Lur

5. MATERIAL & METHODEN 113Zentrifugation (10 Min, 5000 U min-1 4 °C) vom Medium abgetrennt. Die Zellen wurden in40 ml Puffer (EDTA (100 mM) gelöst

5. MATERIAL & METHODEN 114schem Medium mit Galaktose resuspendiert. Die OD600 der Suspension wurde bestimmt undeine 50 ml Kultur mit synthetischem

5. MATERIAL & METHODEN 1155.5.2.6 Kultivierung von Pichia pastorisZur Kultivierung und Lagerung der Hefe wurde YPD Medium verwendet:YPD Pepton (2

5. MATERIAL & METHODEN 1165.5.2.7 Bestimmung des Phänotyps von mit pPICZαA_ROL transformierten PichiapastorisJeweils zwei identische 200 ml Kolbe

5. MATERIAL & METHODEN 117geerntet und bei 1500 x g 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde inder selben Menge eisgekühltem

5. MATERIAL & METHODEN 118zur Transformation verwendet oder langsam bei –80 °C eingefroren. Zur Transformationwurden ca. 3 µg geschnittener DNA i

TABELLENVERZEICHNIS 11Tabelle 1.1: Klonierte Rhizopus sp. Lipasen______________________________________________25Tabelle 1.2: Einsatz von Rhizopus s

5. MATERIAL & METHODEN 119Tropfen Methanol gegeben, um die ROL Produktion zu induzieren. Die Kolonien mit dengrößten gebildeten Halos wurden selek

5. MATERIAL & METHODEN 1205.6.1.2 Isolierung von DNA mit Anionentauscher-Säulen (Qia Spin-Prep)Um eine höhere DNA Qualität z. B. für die Sequenzi

5. MATERIAL & METHODEN 121Die Isolierung von DNA aus Agarosegelen wurde mit dem "QIAquick Gel Extraktion Kit"(Qiagen) durchgeführt. In d

5. MATERIAL & METHODEN 122Die Vervielfältigung der DNA wird durch eine Dreischrittsequenz erreicht:• Denaturierungsschritt: Die zu amplifizierend

5. MATERIAL & METHODEN 123Tabelle 5.8: Beispiel für ein typisches PCR ProgrammSchritt Temperatur (° C) Zeit (Min.) ZyklenDenaturierung 95 7:00 1De

5. MATERIAL & METHODEN 124Tabelle 5.9: Zusammensetzung einer typischen SequenzierreaktionKomponente VolumenDNA Sequenzierkit (Polymerase, Puffer,d

5. MATERIAL & METHODEN 125dem Filtrieren der Lösung wurden 24 µl TEMED, sowie 180 µl APS-Lösung (10 %(w/v)) zu-gegeben bevor sie zwischen zwei Gla

5. MATERIAL & METHODEN 126getrennt und der Elternstrang steht für den nächsten Programm-Zyklus (siehe Tabelle 5.12,vergleiche mit Tabelle 5.8) als

5. MATERIAL & METHODEN 127Tabelle 5.11: Beispiel für einen typischen Ansatz zur Mutagenese durch Quick ChangeKomponente Volumen10 x Puffer 10 µlDN

5. MATERIAL & METHODEN 1285.7 Arbeiten mit Proteinen5.7.1 Proteinanalyse5.7.1.1 SDS-PAGEDie SDS-PAGE wurde analog Laemmli (Laemmli 1970) durchg

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 12% (v/v) Volumenprozent% (w/v) GewichtsprozentµF Mikrofaradµg MikrogrammAbb. AbbildungAmp AmpicillinAOX AlkoholdioxygenaseATCC

5. MATERIAL & METHODEN 129gefärbte Gel wurde in eine Entfärbelösung (Methanol (30 % (v/v), Eisessig (10 % (v/v)) über-führt und solange inkubiert,

5. MATERIAL & METHODEN 130Eventuell noch vorhandene Luftblasen wurden mit einem Glasstab entfernt.Nach dem Blotten (15-30 Min, 15 V) wurde die Mem

5. MATERIAL & METHODEN 1315.8 Proteinreinigung5.8.1 Reinigung der ROL aus Pichia pastoris in synthetischem und komplexem Medium5.8.1.1 Konzentr

5. MATERIAL & METHODEN 132weils mit linearen Gradienten zuerst mit dH2O, dann mit Natriumcholat in Wasser (1%(w/v),gefolgt von Triton X-100 (1% (w

5. MATERIAL & METHODEN 1335.9.1 Metallaffinitätschromatographie (Ion Metal Affinity Chromatography, IMAC)Das Säulenmaterial (20 ml Chelating Seph

5. MATERIAL & METHODEN 134die Aktivität bestimmt. Die freigesetzten Fettsäuren wurden automatisch gegen 0,01 N NaOHtitriert, um den pH konstant zu

6. LITERATUR 1356 LiteraturBasheer, S. K., Mogi, K.-I. und Nakajima, M. (1995). “Development of a novel hollow-fibremembrane reactor for the interest

6. LITERATUR 136Berger, M., Laumen, K. und Schneider, M. P. (1992). “Enzymatic esterification of glycerol I:Lipase-catalyzed synthesis of regioisomeri

6. LITERATUR 137Braun, P., Waldmann, H. und Kunz, H. (1992). “Selective enzymatic removal of protectingfunctions: heptyl esters as carboxy protecting

6. LITERATUR 138Catoni, E., Schmidt-Dannert, C., Brocca, S. und Schmid, R. D. (1997). “Overexpression oflipase A and B of Geotrichum candium in Pichia

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 13Mut+Methanol toleranter Phänotyp von Pichia pastorisMutSMethanol sensitiver Phänotyp von Pichia pastorisNi-NTA Nickel-Nitriloe

6. LITERATUR 139de Vries, Y., Arvidson, D. N., Waterham, H. R., Cregg, J. M. und Woldegiorgis, G. (1997).“Functional characterization of mitochondrial

6. LITERATUR 140Flenker, J. und Spener, F. (1990). “Hydroxy-monoglycerides by lipases-catalyzed partialhydrolysis of castor oil.” DECHEMA Biotechnol.

6. LITERATUR 141Haas, M. J. und Joerger, R. D. (1995). Lipases of the genera Rhizopus and Rhizomucor:Versatile catalysts in nature and the laborator

6. LITERATUR 142Holmquist, M., Tessier, D. C. und Cygler, M. (1997). “Identification of residues essential fordifferential fatty acyl specificity of G

6. LITERATUR 143Kugimiya, W., Otani, Y., Kohno, M. und Hashimoto, Y. (1992). “Cloning and sequenceanalysis of cDNA encoding Rhizopus niveus lipase.” B

6. LITERATUR 144Melchers, K., Weitzenegger, T., Buhmann, A., Steinhilber, W., Sachs, G. und Schafer, K. P.(1996). “Cloning and membrane topology of a

6. LITERATUR 145Oba, T. und Witholt, B. (1994). “Interesterification of milk fat with oleic acid catalyzed byimmobilized Rhizopus oryzae lipase.” J. D

6. LITERATUR 146Rosenfeld, S. A., Nadeau, D., Tirado, J., Hollis, G. F., Knabb, R. M. und Jia, S. (1996).“Production and purification of recombinant h

6. LITERATUR 147Shen, S., Sulter, G., Jeffries, T. W. und Cregg, J. M. (1998). “A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression

6. LITERATUR 148Sreekrishna, K. und Kropp, K. E. (1996). Pichia pastoris. Nonconventional yeasts inBiotechnology - a handbook. Herausgeber: Wolf, K. B

1. EINLEITUNG 141 Einleitung1.1 Lipasen1.1.1 ÜbersichtLipasen (Triacylglycerin-Acylhydrolasen, E.C. 3.1.1.3) hydrolyieren die Ester-Bindungen inTri

6. LITERATUR 149Uyttenbroeck, W., Hendriks, D., Vriend, G., de Baere, I., Moens, L. und Scharpé, S. (1993).“Molecular characterization of an extracell

6. LITERATUR 150Wegner, E. H. (1983). "Biochemical conversion by yeast fermentation at high cell densities."Phillips Petroleum Company Paten

6. LITERATUR 151Zhu, A., Monohan, C., Zhang, Z., Hurst, R., Leng, L. und Goldstein, J. (1995). “High-levelexpression and purification of coffee bean α

LebenslaufName Stefan MinningGeburtsdatum/ -ort 21. Februar 1969 in StuttgartWissenschaftliche Ausbildung:Oktober 1990 – Dezember 1996 Chemie-Studium

1. EINLEITUNG 15+3HOROLipaseOOOORORROOHOHOHR = C7H15Abbildung 1.1: Hydrolyse eines Triacylglycerins am Beispiel der Spaltung vonTrioctanoin mit einer

1. EINLEITUNG 161.1.2 Struktur und Reaktionsmechanismus von LipasenLipasen gehören zur Familie der Serin-Hydrolasen. Die Gemeinsamkeit aller Lipasen

1. EINLEITUNG 17Asp204OONNHHis257HOSer145HNThr83HNLeu146HNThr83NNHis257Asp204OOHHOSer145OROHNLeu146Asp204OONNHis257HHNThr83OSer145OHNLeu146NNHis257Asp

1. EINLEITUNG 18Bei allen bisher strukturell aufgeklärten Lipasen liegt eine sogenannte α/β-Hydrolasefaltungals gemeinsames Motiv vor (Ollis, et al. 1

Das Licht der Wissenschaft birgt die Gefahr,daß man glauben kann, die Welt und man selbstseien ganz erfaßt, während man in Wirklichkeit vonder Lichtqu

1. EINLEITUNG 191.1.3 Reaktionen mit Lipasen1.1.3.1 HydrolyseEin Beispiel für die Hydrolyse von Estern mit Lipasen ist die Spaltung von Triglyceride

1. EINLEITUNG 201.1.3.2 Veresterung und UmesterungLipasen tolerieren neben Wasser auch andere Nukleophile als Substrat, wie z. B. Alkohole,Amine und

1. EINLEITUNG 211.1.4 Anwendung von LipasenWie oben erwähnt, finden Lipasen in zahlreichen Reaktionen Verwendung. Entsprechend derSubstrate kann man

1. EINLEITUNG 22starke 1,3-Regioselektivität bei der Hydrolyse von Triglyceriden aus, unterscheiden sich je-doch leicht durch ihre Stereoselektivität

1. EINLEITUNG 23Die Vorgehensweise ist folgende, es werden zuerst die Aminosäuresequenzen der Proteineverglichen und bestmöglich überlagert. Anschließ

1. EINLEITUNG 24Folglich wurden von Scheib et al. der Austausch von L258 gegen das kleinere Alanin, daskleinere und polare Serin und das größere Pheny

1. EINLEITUNG 25PrePro- und der Pro-Lipase zugeordnet werden konnten. Eine vollständige Prozessierung desPrePro-Enzyms in E. coli findet folglich nich

1. EINLEITUNG 26Synthese von 1-, 2- oder 3-Monoacylglyceriden (1-, 2-, oder 3-MAG) findet sich in Tabelle1.2 und in der Literatur (Bornscheuer, et al.

1. EINLEITUNG 27Tabelle 1.2: Einsatz von Rhizopus sp. Lipasen zur Spaltung und Synthese vonGlyceridesternLipase Edukte Produkte LiteraturRAL1)Sheaöl –

1. EINLEITUNG 281.1.5.4.3 Rhizopus sp. Lipasen in der SchutzgruppenchemieLipasen werden häufig in der Schutzgruppenchemie für Kohlenhydrate eingesetz

DANKSAGUNGDanksagungMein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Rolf D. Schmid für seine Unterstützung im Verlaufdieser Arbeit und die hervorragenden Arbeit

1. EINLEITUNG 291.2 Expressionssysteme1.2.1 AllgemeinesSeit Mitte der achtziger Jahre wurde das Verständnis der Genexpression ständig erweitert.Schl

1. EINLEITUNG 30Tabelle 1.3: Eigenschaften verschiedener ExpressionssystemeEigenschaft Bakterien Hefen und Pilze Insektenzellen SäugerzellenZell-Wachs

1. EINLEITUNG 311.2.2 Verwendung von Pichia pastoris als Expressionssystem1.2.2.1 Entwicklung von Pichia pastoris zu einem Expressionssystem für het

1. EINLEITUNG 32vektoren, in die das zu exprimierende Gen kloniert wird, enthalten das für die Histidinolde-hydrogenase kodierende Gen. Nach der Trans

1. EINLEITUNG 33Tabelle 1.4: Einige Beispiele für die heterologe Genexpression in Pichia pastorisOrganismus Protein Sekretion ReferenzEscherichiaβ-Lac

1. EINLEITUNG 341.3 Proteinreinigung1.3.1 Konventionelle ProteinreinigungsmethodenDie Proteinreinigung ist heute ein weit gefächertes Gebiet. Die Gr

1. EINLEITUNG 351.3.2.1 IMACDie Metallaffinitätschromatography (engl.: Immobilized Metal Affinity Chromatography;IMAC) ist eine effektive Methode, um

1. EINLEITUNG 36Die Metallaffinitätschromatographie basiert auf der reversiblen Bindung von Metallionen(meist Cu2+, Ni2+ oder Zn2+) an eine Matrix. Da

1. EINLEITUNG 37die Proteinaufreinigung gezeigt werden. Das Fusionsprotein band doppelt so stark an die Ni-NTA-Matrix (Qiagen), verglichen mit demselb

1. EINLEITUNG 38Neben der einfachen Aufreinigung mit dem ThioBond™-Material (Invitrogen) (Abbildung1.12) bietet dieser Tag einige weitere Vorteile, wi

INHALTSVERZEICHNIS 31EINLEITUNG ____________________________________________141.1 LIPASEN ________________________________________________________141.

1. EINLEITUNG 39Verdacht, für die Entstehung von Magengeschwüren und Magenkrebs verantwortlich zu seinund wird deshalb intensiv untersucht. Während di

1. EINLEITUNG 401.4 AufgabenstellungDie Lipasen aus der Familie Rhizopus sind wertvolle Biokatalysatoren, insbesondere in derFettmodifikation. Dabei

2. ERGEBNISSE 412 Ergebnisse2.1 Klonierung und Expression der Lipase aus Rhizopus oryzae inPichia pastoris2.1.1 Klonierung des Gens der reifen ROL

2. ERGEBNISSE 42pT1OmpAROL5858 bps10002000300040005000ClaINotINdeIBamHISalIXbaIXbaIAflIIoricI857PRPLOmpAROLfd ampAbbildung 2.1: Expressionsvektor pCY

2. ERGEBNISSE 43500100015002000250030003500PPICZαA3593 bpsSacIHindIIIEcoRISacIINotIXbaIBamH5´AOX1α-factorhis-tagColE1SmaIZeocinPGAPZαA3147bps500100015

2. ERGEBNISSE 442.1.2 Transformation und Expression der ROL in Pichia pastoris GS 115 (his 4)Zu Beginn der Arbeit wurde der Pichia pastoris Stamm GS1

2. ERGEBNISSE 452.1.2.1 Durchmusterung verschiedener mit pPICZαA_ROL transformierter Klone auf ihreFähigkeit ROL zu produzierenDie selektierten Zeoci

2. ERGEBNISSE 46Ausbeute an aktiver Lipase im Überstand linear mit der Zellenzahl und damit mit der OD600der Kulturbrühe steigt und so die gemessenen

2. ERGEBNISSE 472.1.2.3 Durchmusterung verschiedener Klone transformiert mit pGAPZαA_ROL auf ihreFähigkeit ROL zu produzierenZeocin-resistente, mit d

2. ERGEBNISSE 482.1.3 Transformation und Expression der ROL in Pichia pastoris X-33In dem in Kapitel 2.1.2 verwendeten Pichia Stamm GS 115 wurde als

INHALTSVERZEICHNIS 41.4 AUFGABENSTELLUNG______________________________________________402ERGEBNISSE____________________________________________412.1 K

2. ERGEBNISSE 49hier das Ansetzen mehrerer Kulturen empfehlenswert. Der zeitliche Aufwand ist mit dem fürdie Elektroporation vergleichbar, auch hier i

2. ERGEBNISSE 50200 Transformanten pro Transformationsansatz und damit die höchsteTransformationseffizienz.Tabelle 2.1 zeigt eine Zusammenfassung der

2. ERGEBNISSE 512.2 Fermentation von Pichia pastoris zur ROL ProduktionAlle Fermentationsstudien wurden mit dem Klon 3-3 aus dem Wildtyp-Stamm X-33 t

2. ERGEBNISSE 52Abbildung 2.5: Fermentation 1 in komplexem Medium mit Methanolzugabe nachjeweils 24 h.(❍) Biofeuchtmasse (BWW), (●) OD600, ( ) Lipasea

2. ERGEBNISSE 532.2.2 Kultivierung in komplexem Medium mit Glycerin Fed-BatchDie Analyse der Fermentationen 1 und 2 ergab, daß zur Erhöhung der Ausbe

2. ERGEBNISSE 54Nach ca. 16 h zeigte der starke Anstieg des DO-Werts den vollständigen Konsum desGlycerins durch die Hefe an (Abbildung 2.7). Daraufhi

2. ERGEBNISSE 55Daher wurde als Ausgangspunkt für die Fütterungsstrategie bei Fermentation 4 die vonInvitrogen (Fermentation Guidelines for the methyl

2. ERGEBNISSE 56So stellte sich bei der späteren Analyse des Methanolgehaltes von Proben aus dieser Fermen-tation mittels GC (Abbildung 2.9) heraus, d

2. ERGEBNISSE 57des Lufteintrags konnte der zwischenzeitlich auf nahezu 0 % abgesunkene Wert für dengelösten Sauerstoff wieder auf über 20 % erhöht we

2. ERGEBNISSE 58Abbildung 2.10: Kallibriergerade für die Bestimmung des Methanolgehalts insynthetischem Basalsalz Medium.Die einfache Probenvorbereit

INHALTSVERZEICHNIS 52.3.3 CHARAKTERISIERUNG DER ROL AUS PICHIA PASTORIS UND VERGLEICH MIT DER ROL AUS E. COLI_________________________________________

2. ERGEBNISSE 592.2.5 Kultivierung in synthetischem Medium mit Methanol-AnalytikAus den vorangegangenen Fermentationen wurde geschlossen, daß die Met

2. ERGEBNISSE 60Erst 40 h nach Beginn der Induktion konnte zum ersten Mal Lipaseaktivität im Mediumnachgewiesen werden. Trotz der strikten Kontrolle d

2. ERGEBNISSE 61Um diese Zeit – und damit die Fermentationsdauer selbst – zu reduzieren, wurde eine Misch-fütterungs-Strategie mit Methanol und Glycer

2. ERGEBNISSE 62Dies ist vergleichbar zu Fermentation 5, jedoch war der Anstieg der Lipaseaktivität wesent-lich steiler. So wurde die in Fermentation

2. ERGEBNISSE 632.3 Aufreinigung und Charakterisierung der ROL aus Pichia pastoris2.3.1 Reinigung der in komplexem Medium kultivierten ROL aus Pichi

2. ERGEBNISSE 64Die ROL verfügt über einen hohen isoelektrischen Punkt von ca. 9,3. Deshalb sollte die wei-tere Reinigung über Kationenaustauschchroma

2. ERGEBNISSE 65Abbildung 2.15: Elutionsprofil der Reinigung von ROL aus Pichia pastoris nachKultivierung in komplexem Medium.(...) Flußrate (ml Mi

2. ERGEBNISSE 6694 kDa67 kDa43 kDa30 kDa20 kDa14 kDaS12354SAbbildung 2.16: SDS PAGE der ROL aus Pichia pastoris kultiviert in komplexemMedium.S LMW St

2. ERGEBNISSE 67überraschenderweise ein negativer Aufreinigungsfaktor, was bedeutete, daß in der Dialyse dieVerunreinigung des Proteins zugenommen hät

2. ERGEBNISSE 68Nach der Reinigung durch Ultrafiltration und Ionenaustauschchromatographie zeigten sichneben der Lipasebande noch ein paar schwächere

INHALTSVERZEICHNIS 63.1.2 UNTERSUCHUNG UND VARIATION VERSCHIEDENER TRANSFORMATIONSMETHODEN IN PICHIAPASTORIS__________________________________________

2. ERGEBNISSE 69zur Elution eingesetzt. Der Einsatz von Natriumcholat (1% (w/v)) als Elutionsmittelresultierte in einigen Fraktionen, die im UV-Bereic

2. ERGEBNISSE 70durchgeführt . Auch hier zeigte sich keine Änderung der Masse (Abbildung 2.16, Spur 3). Dieermittelte Molmasse von ca. 30 kDa entspric

2. ERGEBNISSE 71sehr hohen Wert von über 9,3. Eine genauere Bestimmung des pI-Wertes durch isoelektrischeFokussierung war mit der vorhandenen Ausrüstu

2. ERGEBNISSE 72Ergebnis ergab die Untersuchung der pH-Stabilität. Hier lag das Maximum um pH 7. DerVergleich der Aktivitätsprofile zeigt einen unsymm

2. ERGEBNISSE 73Anders verhält es sich bei der Thermostabilität. Hier zeigt sich, daß die ROL aus Pichiapastoris deutlich stabiler ist, als die aus E.

2. ERGEBNISSE 74deutliche Präferenz der rekombinanten Lipase zu Triglyceriden mit Fettsäuren mittlererKettenlänge.2.3.4 Mutagenese der ROL zur Modifi

2. ERGEBNISSE 752.4 Entwicklung eines Peptid-tags aus der Nickelbindungsstelle derATPase 439 aus Helicobacter pylori (HeliTag)2.4.1 Variation und Kl

2. ERGEBNISSE 762.4.1.2 Verwendung des Green Fluorescent Proteins (EGFP) zur Validierung des HeliTagsUm eine quantitative Auswertung der Eignung der

2. ERGEBNISSE 77einfaches physikalisches Verfahren zur Quantifizierung verwendet werden, die Fluoreszenz-spektroskopie. Die Fluoreszenz stimmt über ei

2. ERGEBNISSE 78PEGFP gfp-2631 bps5001000150020002500AmppUC19 orilacpEGFP HeliTag3388 bps50010001500200025003000NcoINotIAmppUC19 orilacHeliTaggfppEGFP

INHALTSVERZEICHNIS 75.5.2 KULTIVIERUNG, LAGERUNG UND TRANSFORMATION DER MIKROORGANISMEN UNDPROTEINEXPRESSION IN DEN MIKROORGANISMEN __________________

2. ERGEBNISSE 792.4.1.4 Sequenzierung der erzeugten HeliTags zur Validierung ihrer DiversitätAlle sequenzierten RandomHeliTags wiesen unterschiedlich

2. ERGEBNISSE 80das Plasmid pEGFP wurden mit den beiden Enzymen verdaut und die gereinigten DNA-Fragmente isoliert und ligiert. Das Ligationsprodukt w

2. ERGEBNISSE 81Auch die mit EGFP Xa-M13 HeliTag transformierten E. coli Zellen exprimierten aktivesEGFP (EGFP Xa-M13 HeliTag-Protein). Die Kultivieru

2. ERGEBNISSE 82GFP 30 kDaNach der IMAC Reinigung der einzelnen Mutanten in den Membranfilterplatten befüllt mitChelating Sepharose (siehe 5.9) wurde

2. ERGEBNISSE 832.4.1.9 Reinigung von EGFP fusioniert mit dem HeliTag M13 (HeliTag M13-EGFP)Um die Eigenschaften des im High-Throughput Screening (HT

2. ERGEBNISSE 84konnte auch quantititiv durch Fluoreszenzmessung der einzelnen Fraktionen gezeigt werden(Abbildung 2.24). Im Gegensatz dazu zeigt Abbi

2. ERGEBNISSE 85Abbildung 2.25: Reinigung von HeliTag M13-EGFP durch IMAC.Abbildung 2.25A zeigt die Bindung des EGFP nach dem Waschschritt aufder Säul

2. ERGEBNISSE 862.4.1.11 Vergleich des HeliTags M13 und HeliTag Xa M13 mit der Wildtyp-Sequenz unddem His-TagDer His-Tag ist in der Metallaffinitätsc

2. ERGEBNISSE 872.4.1.12 Entfernung des HeliTags M13 durch Behandlung von EGFP Xa-M13 HeliTag-Protein mit Faktor XaDie Entfernung eines Tags nach der

2. ERGEBNISSE 882.4.2 Fusion der ROL aus Pichia pastoris mit dem HeliTag2.4.2.1 Klonierung des HeliTags M13 mit und ohne Xa-Protease-Schnittstelle a

INHALTSVERZEICHNIS 85.7.2 BLOTTEN VON PROTEINEN UND N-TERMINALE PROTEINSEQUENZIERUNG __________________1295.7.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION___

2. ERGEBNISSE 89am N-terminalen Ende, pPICZαA_ROL_HeliC, mit dem HeliTag am C-terminalen Ende undpPICZαA_ROL_XaHeliC mit die Proteaseschnittstelle für

3. DISKUSSION 903 Diskussion3.1 Klonierung der reifen ROL in Pichia pastoris Expressionsvektorenund Transformation in Pichia pastoris3.1.1 Klonieru

3. DISKUSSION 91Dies ist insbesondere deshalb von Interesse, da von Beer et al. eine toxische Wirkung derLipase in E. coli vermutet wurde (Beer 1994),

3. DISKUSSION 92effizienzen reduzieren jedoch den Wert dieser Methode deutlich. Es wurde weiterhin dieTransformation der DNA nach der Methode von Giet

3. DISKUSSION 93Wachstum der Zellen keine Auffälligkeiten zeigten. Die am Ende erreichte Zellmasse warsogar höher, als die unter pPIC-Kontrolle. Unter

3. DISKUSSION 94Gehalts detektiert werden. Die darauf folgende Zugabe von Methanol führte zum unmittel-baren Absinken des DO. Außerdem wurde vor der I

3. DISKUSSION 95Abbildung 3.1: Vergleich des Auftretens von Lipaseaktivität im Fermenterüberstandbei Kultivierung in komplexem Medium (Fermentationen

3. DISKUSSION 96Bei beiden Fermentationen 4 und 5 fiel das gegenüber Fermentation 1 und 3 erst sehr späteinsetzende Auftreten von lipolytischer Aktivi

3. DISKUSSION 97Letztendlich konnte bei der Kultivierung in günstigem, synthetischem Medium eine wesent-lich höhere Ausbeute an aktiver ROL erreicht w

3. DISKUSSION 98Zum Vergleich der Eigenschaften der in verschiedenen Mikroorganismen exprimierten ROLund ProROL wurde die gereinigte reife ROL aus E.