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5. MATERIAL & METHODEN 112

5.5.2.1 Kultivierung von Escherichia coli

E. coli wurde, soweit nicht anders vermerkt, in Luria-Bertani Medium (LB) (Luria, et al.

1960) kultiviert:

LB Trypton (10 g l

-1

), Hefeextrakt (5 g l

-1

), NaCl (5 g l

-1

)

5.5.2.2 Transformation von Escherichia coli durch Hitzeschock

Um chemisch kompetente Escherichia coli herzustellen, wurde eine 50 ml LB-Kultur im

Verhältnis 1:100 mit einer Übernachtkultur angeimpft und solange bei 37 °C, 250 rpm inku-

biert, bis die OD

600

einen Wert zwischen 0,5 – 0,7 erreicht hatte. Nach Zentrifugation (4 °C,

11000xg, 10 Min.) wurde das Pellet in 2 ml TSS (PEG 6000 (10 %(w/v)), DMSO (5 %(v/v)),

MgCl

(50 mM) aufgefüllt mit LB Medium) resuspendiert und in 200 µl Portionen aliquotiert.

Die zu transformierende DNA wurde zugegeben und mindestens 20 Minuten mit den Zellen

auf Eis inkubiert. Um die DNA zu transformieren, wurden die Zellen 45 sek. auf 42 °C er-

hitzt. Anschließend wurden 800 µl LB Medium zugegeben. Die Zellen wurden 60 Min. bei

37 °C und 250 rpm inkubiert und kurz bei 2700xg und 4 °C zentrifugiert. Etwa 700 µl des

Mediums wurden entfernt, die Zellen wurden in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendiert,

auf LB-Agar mit einem geeigneten Selektionsmarker ausplattiert und bei 37 °C über Nacht

inkubiert.

5.5.2.3 Expression von ROL in Escherichia coli

Die Expression der ROL erfolgte nach Beer et al. (Beer 1994, Beer, et al. 1998) und soll des-

halb im Folgenden nur kurz beschrieben werden. Im Gegensatz zu Beer et al. wurde in

diesem Fall der Stamm DH5α transformiert mit pTOmpAROL zur Expression verwendet.

Zum Animpfen der zwei 500 ml LB-Kulturen mit Ampicillin als selektivem Marker (100 µg

-1

) wurden jeweils 2,5 ml einer 5 ml Übernachtkultur verwendet (37 °C). Die Zellen

wurden bis zu einer OD

600

von 0,5-0,8 bei 37 °C kultiviert. Nach Erreichen dieser Zelldichte,

wurde der temperatursensitive λ-Promotor durch eine Temperaturerhöhung auf 42 °C

induziert und die Produktion der Lipase als inaktive Einschlußverbindungen (Inclusion

Bodies) gestartet. Nach 4 h bei dieser Temperatur wurden die Zellen geerntet und durch

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