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2. ERGEBNISSE 51

2.2 Fermentation von Pichia pastoris zur ROL Produktion

Alle Fermentationsstudien wurden mit dem Klon 3-3 aus dem Wildtyp-Stamm X-33 trans-

formiert mit dem Plasmid pPICZαA_ROL durchgeführt. Ziel der Fermentationen war, eine

größere Menge aktiver ROL in einem preisgünstigen Medium herzustellen. Außerdem sollte

eine Methode entwickelt werden ROL in vollsynthetischem Medium, zur Isotopenmarkierung

des Proteins mit

N, zu fermentieren. Aus diesem Grund wurde bei der Untersuchung zur

Kultivierung in synthetischem Medium ganz bewußt auf die Zugabe von beispielsweise

Vitaminen verzichtet. Ein Schritt, der sich natürlich ebenfalls auf die Kosten positiv auswirkt.

Die Aktivitätsbestimmung der Lipase erfolgte im pH Stat (30 °C, pH 8,1; im Fall der Kulti-

vierungen in komplexem Medium mit Triolein, im Fall der Kultivierung in synthetischem

Medium mit Olivenöl, dessen Hauptbestandteil Triolein darstellt).

2.2.1 Kultivierung in komplexem Medium mit unmittelbarer Induktion

Die Fermentationsstudien in komplexem Medium wurden in 5 L Fermenter (Infors) durchge-

führt. Die Übernachtkultur (BMGY, 1:10 des Fermentervolumens) wurde zentrifugiert und

das Zellpellet im selben Volumen BMMY Medium resuspendiert. Mit dieser Kultur wurde

der Fermenter angeimpft. Es wurden zwei verschiedene Fütterungsstrategien angewendet.

Zunächst wurde alle 24 h 0,5 – 1 % Methanol zugegeben(Abbildung 2.5), daraus resultierte

nach 98 h Kultivierung eine Biomasse von 42 g l

-1

. Die Lipaseaktivität im Überstand nach

dieser Zeit betrug 100 U ml

-1

, was einer Produktivität von 1020 U l

-1

entspricht. Durch

eine verbesserte Fütterungsstrategie, in der die Fütterungspulse von dem im A/jointfilesconvert/483621/bgas gemes-

senen CO

-Wert abhängig gemacht wurden, konnte die Produktivität auf 1840 U l

-1

ge-

steigert werden (Abbildung 2.6). Dies entspricht einer Aktivität von 180 U ml

-1

nach einer

Kultivierungsdauer von 89 h.

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