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2. ERGEBNISSE 46

Ausbeute an aktiver Lipase im Überstand linear mit der Zellenzahl und damit mit der OD

600

der Kulturbrühe steigt und so die gemessenen Aktivitäten (Triolein bei 30 °C im pH Stat) auf

eine OD

600

von 15 normiert. Um die Fehlerrate möglichst gering zu halten, wurden nur Kulti-

vierungen berücksichtigt, die am Ende eine OD

600

von 15 ± 5 aufwiesen.

In allen Überständen konnte Lipaseaktivität nachgewiesen werden. Die gemessene Aktivität

differierte zwischen den einzelnen Klonen jedoch sehr stark. Klon 23, der Klon mit der

höchsten Aktivität (bezogen auf die OD

600

; siehe Abbildung 2.4) wurde ausgewählte und im

500 ml Maßstab im Schüttelkolben kultiviert (Lipaseaktivität im Kulturüberstand: 110 U ml

-1

bzw. spezifischen Aktivität: 13,8 U mg

-1

(pH Stat, Triolein, 30 °C). ROL aus dieser Kultivie-

rung wurde für die Reinigung, die Charakterisierung und den Vergleich der ROL aus

P. pastoris mit denen aus anderen Expressionssystemen verwendet (siehe Kapitel 3.4).

2.1.2.2 Bestimmung des Phänotyps verschiedener Pichia pastoris Klone transformiert mit

pPICZαA_ROL

Der Expressionsvektor pPICZαA_ROL enthält die Promotorsequenz des AOX1 Genes aus

Pichia pastoris, sowie die Terminationssequenz für den ORF des AOX1 Genes. Durch die

Linearisierung des Plasmids zwischen diesen beiden Genabschnitten kann es bei der Re-

kombination zu einem sogenanten Double-Crossover kommen. Bei diesem wird im Gegen-

satz zum Single-Crossover die für die AOX1 kodierende Gensequenz aus dem Genom der

Hefe herausrekombiniert, dies führt zum Mut

-Phänotyp, der eine erhöhte Sensitivität

gegenüber Methanol im Vergleich zum Wildtyp (Mut

) besitzt. Dies rührt daher, daß der

Zelle anstatt der stark exprimierten AOX1 nur die schwach exprimierte AOX2 zur

Metabolisierung von Methanol zu Verfügung steht. In der Regel entstehen bei der Transfor-

mation Mischformen der beiden Phänotypen, die durchaus unterschiedliche Expressionsraten

zeigen können. Es wurden zehn verschiedene Klone und der untransformierte Stamm GS115

in 50 ml Kulturen auf ihre Fähigkeit untersucht, auf Methanol zu wachsen. Während der un-

transformierte Stamm GS115 sowohl in BMGY, als auch in BMMY mit nahezu derselben

Geschwindigkeit wuchs, zeigten alle Klone ein deutlich langsameres Wachstum in BMMY

gegenüber BMGY. Die Wiederholung dieses Versuches mit zehn Klonen aus der Transfor-

mation des Pichia pastoris Stammes X-33 ergab das gleiche Ergebnis.

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