Bosch PPS8 C2 Series Bedienungsanleitung PDF herunterladen (Seite 6)

INHALTSVERZEICHNIS 5

2.3.3 CHARAKTERISIERUNG DER ROL AUS PICHIA PASTORIS UND VERGLEICH MIT DER ROL AUS E. COLI

____________________________________________________________________________69

2.3.3.1 Allgemeine Charakterisierung ____________________________________________________69

2.3.3.2 pH-Stabilität und pH-Optimum ___________________________________________________71

2.3.3.3 Temperatur-Stabilität und Temperatur-Optimum _____________________________________72

2.3.3.4 Substratspektrum ______________________________________________________________73

2.3.4 M

UTAGENESE DER ROL ZUR MODIFIKATION DER STEREOPRÄFERENZ GEGENÜBER

TRIACYLGLYCERIN ANALOGA ____________________________________________________74

2.4 ENTWICKLUNG EINES PEPTID-TAGS AUS DER NICKELBINDUNGSSTELLE DER

ATPASE 439 AUS HELICOBACTER PYLORI (HELITAG)_____________________75

2.4.1 VARIATION UND KLONIERUNG DER NICKELBINDUNGSSTELLE AUS DER ATPASE 439 AUS

HELICOBACTER PYLORI AN EGFP __________________________________________________75

2.4.1.1 Herstellung der Peptid-Bibliothek _________________________________________________75

2.4.1.2 Verwendung des Green Fluorescent Proteins (EGFP) zur Validierung des HeliTags _________76

2.4.1.3 Fusion der Random-HeliTag Sequenzen an EGFP ____________________________________77

2.4.1.4 Sequenzierung der erzeugten HeliTags zur Validierung ihrer Diversität____________________79

2.4.1.5 Fusion der Nickelbindungsstelle der ATPase 439 (WtHeliTag) aus Helicobacter pylorian EGFP 79

2.4.1.6 Fusion des HisTag an EGFP _____________________________________________________80

2.4.1.7 Fusion des X

-M13-HeliTag an EGFP______________________________________________80

2.4.1.8 Durchmusterung auf neue Peptidsequenzen zur IMAC (HeliTags)________________________81

2.4.1.9 Reinigung von EGFP fusioniert mit dem HeliTag M13 (HeliTag M13-EGFP) ______________83

2.4.1.10 Untersuchung der Bindung von HeliTag M13-EGFP an verschiedene Metalle ______________84

2.4.1.11 Vergleich des HeliTags M13 und HeliTag X

M13 mit der Wildtyp-Sequenz und dem His-Tag_86

2.4.1.12 Entfernung des HeliTags M13 durch Behandlung von EGFP X

-M13 HeliTag-Protein mit

Faktor X

____________________________________________________________________87

2.4.2 F

USION DER ROL AUS PICHIA PASTORIS MIT DEM HELITAG ______________________________88

2.4.2.1 Klonierung des HeliTags M13 mit und ohne X

-Protease-Schnittstelle an das N- und C-terminale

Ende der ROL ________________________________________________________________88

3DISKUSSION ____________________________________________90

3.1 KLONIERUNG DER REIFEN ROL IN PICHIA PASTORIS EXPRESSIONSVEKTOREN

UND TRANSFORMATION IN PICHIA PASTORIS____________________________90

3.1.1 KLONIERUNG UND TRANSFORMATION DES ROL GENS IN PICHIA PASTORIS __________________90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ... 152 153

Keine Kommentare

Bosch PPS8 C2 Series Bedienungsanleitung Seite 6