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2. ERGEBNISSE 42

pT1OmpAROL

5858 bps

1000

2000

3000

4000

5000

ClaI

NotI

NdeI

BamHI

SalI

XbaI

AflII

ori

cI857

PRPL

OmpA

ROL

amp

Abbildung 2.1: Expressionsvektor pCYTEXP1 mit dem ROL-Gen.

Das ROL-Gen wurde an die OmpA-Sequenz unter Kontrolle des λ-

Promotors (PRPL) fusioniert, wie von Beer et al. (Beer, et al. 1998) zur

Expression der ROL in E. coli verwendet.

Zur Expression der ROL wurde das ROL-Gen in beide oben beschriebenen Expressions-

vektoren kloniert und in Pichia pastoris transformiert. Zur Integration des ROL-Gens in

frame hinter den α-Faktor der Vektoren wurde dieses aus dem Expressionsvektor

pT1OmpAROL mittels einer PCR Reaktion amplifiziert. Dazu wurden zwei flankierende

Primer ROL_Eco1 und ROL_Not2 verwendet, die am 5´-Ende des Fragments eine EcoRI -

und an das 3´-Ende eine NotI-Schnittstelle anfügten. Zusätzlich wurden zwei Stop-Codons

am 3´-Ende des Gens eingeführt, um die Fusion des Lipase-Gens mit dem auf dem Plasmid

vorhandenen His-tag zu verhindern. Das erhaltene 800 bp PCR Fragment wurde mit EcoRI

und NotI verdaut, ebenso wie die Vektoren pPICZαA und pGAPZαA (Abbildung 2.2).

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