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3. DISKUSSION 93

Wachstum der Zellen keine Auffälligkeiten zeigten. Die am Ende erreichte Zellmasse war

sogar höher, als die unter pPIC-Kontrolle. Unter Umständen könnte sogar das verstärkte

Wachstum ein Grund für die geringere ROL Expression sein.

3.3 Optimierung der Kultivierungsbedingungen für Pichia pastoris zur

Produktion von ROL unter Kontrolle des AOX1-Promotors

Obwohl es schon eine ganze Reihe von Veröffentlichungen zur Fermentation von Pichia

pastoris gibt (Review: (Stratton, et al. 1998)), müssen für jedes Protein die Bedingungen,

insbesondere die Fütterungsstrategie, sowie pH, Medienbestandteile usw. neu optimiert wer-

den.

Dabei ist insbesondere die Bestimmung des Phänotyps hinsichtlich der Verwertung von

Methanol von entscheidender Bedeutung, da von ihm die eingeschlagene Fütterungsstrategie,

insbesondere in synthetischem Medium bei kontinuierlicher Fütterung, abhängt. Der Ver-

gleich der Wachstumsraten der transformierten Zellen in Glycerin bzw. Methanol ergab, daß

alle zehn getesteten Klone dem Mut

-Phänotyp (Methanol sensitiv) angehörten, d. h. daß das

für Alkoholoxidase I kodierende Gen während der Integration deletiert wurde, ein Vorgang,

der laut Literatur statistisch nur bei 10-20 % der Transformanten auftreten sollte (Cregg

1999).

Dies ist jedoch nicht unbedingt ein Nachteil, da auch schon höhere Expressionsraten bei

Mut

-Phänotypen beobachtet wurden (Cregg, et al. 1987). Allerdings ist bei Mut

-Phänotypen

eine genauere Analyse des Methanolgehaltes in der Kulturbrühe notwendig (siehe unten).

Bei der Expression der ROL im Fermenter stellte sich heraus, daß in komplexem Medium

durch eine einfache Fütterungsstrategie aktive Lipase hergestellt werden kann. Wurde in der

ersten Fermentation durch Füttern von 1% (v/v) Methanol alle 24 h die Ausbeute mit 110 U

-1

gegenüber der Kultivierung im Schüttelkolben nicht gesteigert, führte die Analyse des

-Anteils im A/jointfilesconvert/483621/bgas (Fütterung, wenn der CO

-Gehalt im A/jointfilesconvert/483621/bgas sank) schon zu einer ver-

besserten Ausbeute von 180 U ml

-1

. Diese Analyse stellte sich jedoch als fehleranfällig her-

aus, da der Anteil von CO

im A/jointfilesconvert/483621/bgas, abhängig von der zugeführten Luft, Schwankungen

unterlag. Deshalb wurde in Fermentation 3 die Zugabe von Methanol zur Induktion und Fütte-

rung vom gelösten Sauerstoff (DO-Wert) in der Fermenterbrühe abhängig gemacht. Jedesmal,

wenn das Methanol verbraucht war, konnte dies durch einen signifikanten Anstieg des DO-

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