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3. DISKUSSION 100

Die pH Aktivität und Stabilität der reifen Lipasen aus Pichia pastoris und E. coli wurde unter

gleichen Bedingungen untersucht und zeigten ein identisches Profil (vergleiche auch (Beer

1994, Beer, et al. 1998, Ben Salah, et al. 1994)), das mit dem von Ben Salah et al. veröffent-

lichten für die ROL aus Rhizopus oryzae übereinstimmt (Ben Salah, et al. 1994). Im Gegen-

satz dazu werden von der ProROL völlig andere Profile und pH Optima berichtet (Beer 1994,

Beer, et al. 1998). Bei allen Proteinen liegt das pH-Optimum in der Nähe des isoelektrischen

Punktes. Dies wurde von Haas et al.so interpretiert, daß durch die Neutralisierung der Ladung

an der Außenseite der Proteine die Bindung an der Interphase verbessert wird (Haas, et al.

1992).

Die Lipase aus Rhizopus oryzae exprimiert in E. coli ist relativ thermolabil, bei Temperaturen

über ihrem Temperaturoptimum von 30 °C zeigt sie schon deutliche Denaturierungs-Erschei-

nungen. Dies wurde von Beer et al. auf ihren niedrigen Schmelzpunkt von 38 °C gegenüber

59 °C bei der ProROL zurückgeführt (Beer 1994). Die Umsetzung von Triolein mit der reifen

ROL bei verschiedenen Temperaturen wurde von Ben Salah et al. beschrieben (Ben Salah, et

al. 1994), so konnte bei 50 °C keine Aktivität mehr detektiert werden. Bei dieser Temperatur

wurde auch die rekombinante ROL aus E. coli inaktiviert. Für die ProRDL wurde eine höhere

Temperaturstabilität beschrieben, jedoch nur in Abwesenheit des Substrats, bei Inkubation mit

Triolein konnte keine erhöhte Thermostabilität mehr festgestellt werden (Joerger und Haas

1993).

Erstaunlicherweise zeigte die reife Lipase aus Pichia pastoris eine erhöhte Thermostabilität

gegenüber der aus E. coli. Ob dies auf die bessere in vivo Faltung in der Hefe oder die Ein-

führung der zwei zusätzlichen Aminosäuren am N-terminalen Ende durch die Klonierung in

pPICZαA zurückzuführen ist, konnte nicht zweifelsfrei geklärt werden.

Der Vergleich der Substratspezifität der ROL Präparationen aus E. coli und P. pastoris ergab

eine Übereinstimmung in der Kettenlängenspezifität. Für beide Enzyme wurde eine Präferenz

für moderate Kettenlängen zwischen C8 und C18 festgestellt. Sehr kurze und sehr lange Fett-

säureester werden hingegen kaum hydrolysiert. Eine ähnliche Kettenlängenspezifität wurde

auch von Klein et al. und Joerger et. al gefunden (Joerger und Haas 1994, Klein, et al. 1997).

In einer anderen Arbeit wurde von Shimada et al. die Spezifität der ROL gegenüber lang-

kettigen teils mehrfach ungesättigten Fettsäuren untersucht. Während C18 Fettsäuren noch

gut umgesetzt wurden, sank die Aktivität bei C20 Fettsäuren schon um 75 % ab (Shimada, et

al. 1997).

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