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5. MATERIAL & METHODEN 121

Die Isolierung von DNA aus Agarosegelen wurde mit dem "QIAquick Gel Extraktion Kit"

(Qiagen) durchgeführt. In diesem wird das DNA enthaltende Stück des Agarosegels gelöst

und auf einer Silikagel enthaltenden Säule immobilisiert. Nach verschiedenen Waschschritten

wurde die DNA mit 50 µl H

O eluiert.

5.6.4 In-vitro Manipulation an DNA: Restriktionsverdau, Ligation, Behandlung mit

alkalischer Phosphatase, Klenow-Behandlung und Phenolisierung

Restriktionsverdaue und Ligationen wurden nach den Angaben der Hersteller der Enzyme

durchgeführt. Um bei der Ligation von nur mit einem Enzym geschnittener Plasmid DNA

deren Selbstligation zu verhindern, wurden die 5´-ständigen Phosphatreste durch alkalische

Phosphatase aus Kälberdarm a/jointfilesconvert/483621/bgespalten. Um 5´-Überhänge z. B. nach dem Restriktionsver-

dau aufzufüllen, um mit glatten Enden zu ligieren, wurde das Klenow-Fragment verwendet.

Um geschnittene Fragmente und verwendete Enzyme von der DNA abzutrennen, wurden die

Inkubationsansätze in der Regel auf ein Agarosegel aufgetragen und die gewünschte DNA

daraus extrahiert, in Einzelfällen wurde der Ansatz nur phenolisiert und mit Ethanol

präzipitiert.

5.6.5 Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR)

Die PCR ermöglicht es, beliebige DNA Fragmente enzymatisch in vitro zu amplifizieren.

Neben dem Enzym, einer DNA-Polymerase, sind dabei die Zugabe der Desoxyribonukleotide

(dNTP´s), sowie zwei kurze, synthetisch hergestellte DNA-Moleküle (Primer) nötig.

Je einer dieser Primer ist komplementär zu einem der beiden Enden des gewünschten

Fragments beider DNA-Stränge.

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